НОВАЯ МИКРОСКОПИЯ. Левёнгук
Несмотря на революцию в оптической мышлении, одновременно были достигнуты многочисленные поразительные успехи в конструировании оптических приборов целиком на основе классической волновой теории прошлого века. В этом разделе мы отчасти коснемся этих новых достижений, и прежде всего нового мощного подъема техники микроскопии.
История создания микроскопа в целом заняла немало времени. Весьма вероятно, что примерно в то же время, когда Ганс Липперсгейм изобрел в 1610 г. телескоп он также изобрел и микроскоп. В 1665 г. Роберт Гук первым построил микроскоп в том виде, каким мы знаем его в наши дни, — с двумя линзами. Первая линза, называемая объективом, может давать довольно большое увеличение (часто в сотни раз), а следующая за ней вторая линза — оруляр может увеличивать первичное изображение еще раз в 20 или что-нибудь в этом роде, в результате возможно общее увеличение до 2000 раз.
Первые микроскопы XVII в. серьезно страдали от так называемой хроматической аберрации. Линза в каком-то смысле ведет себя как призма и вследствие этого добавляет к белому цвету различные цвета с различными положениями фокуса, что ведет к размытию изображения. Уже в 1665 г. Ньютон отметил эту трудность в связи с конструированием и линзовых телескопов и линзовых микроскопов, Одним из следствий хроматической аберрации -было то, что конструкторы стали пользоваться линзами малого диаметра.
Был, правда, один чудак-индивидуалист, который делал самые лучшие микроскопы, хотя его имя стоит особняком в вбщем ходе развитая здшфвскопяи. Это был голландский торговец мануфактурой Антони ван Левенгук (род. в 1632 т.), проживший всю жизнь в родном городе Дельфте, тде он и умер в 1723 яг. В отличие от своих современников он не тгользоваяся двухлинзовым (сложным) микроскопом, а работал с одной линзочкой, которую он делал из небольшого стеклянного шарика, расплавляя стекло в пламени. Затея он придавал соответствующую кривизну поверхностям линзы, используя для этой цели небольшие шлифовальные приспособления, которые он сам сконструировал. Крохотная линзочка (она могла быть поперечником меньше миллиметра) закреплялась между двумя небольшими отверстиями в грубо сделаэшых металлических пластинках из меди или -серебра. Подвергаемый проверке-объект устанавливался в фокусе три помощи грубого винтового устройства, теотда как сама линза оставалась деподвижной. Левенгук сделал не менее 400 таких микроскопов с широким диапазоном увеличений, часто создавая отдельный микроскоп для определенного объекта, держа его непрерывно под линзой. После его смерти двадцать микроскопов перешли к Королевскому обществу, членом которого был Левенгук, ио они куда-то загадочно исчезли, и следы их так никогда и не были обнаружены.
Левёнгук
Левенгук сообщал об открытии таких мельчайших биологических объектов, как простейшие и бактерии, в которые он в то время едва поверил. Но, сообщая о своих безупречных наблюдениях Королевскому обществу, Левенгук письменно заверял результаты своих наблюдений голландскими-властями Делъфта, которых он приглашал посмотреть на свои объекты и которые в за* мешательстве подписывали свидетельства, подтверждающие ценность его отчета. Не однажды Королевское общество насылало своих эмиссаров, чтобы те иепосредственно дали отчет об увиденном, н энтузиазм этих «соглядатаев» вынудил Королевское общество относиться с величайшим уважением ко всем сообщениям Левенгука.
Никто не мог Делать линзы лучше Левенгука, а он -упрямо отказывался открыть свой метод освещения, который, безусловно, играл существенную роль при некоторых наблюдениях и который другие не могли воспроизвести. В письмах он утверждал, что «хранит для себя одного и свои самые лучшие микроскопы, и свой осрбый способ наблюдения малых созданий». Возможно, Левёнгук владел специальными методами освещения. Которые позволяли ему отчетливо видеть «го объекты. Ибо вновь и вновь в своих письмах он говорит, что не возражает дать микроскоп кому-либо из друзей или коллег, но отказывается раскрыть свой метод, как сделать объект ясно видимым. Возможно, что он открыл для себя так называемое «темнопольное» освещение — способ наблюдений, применяемый в наши дни, в котором используются специальные устройства, делающие слабые объекты ярко освещенными на темном фоне.
Покойный профессор Утрехтского университета ван .Ситтерт демонстрировал мне необычные возможности микроскопов, находившихся в распоряжении Левенгука. К счастью, в университетском музее в Утрехте существует один полностью сохранившийся микроскоп Левенгука. (Возможно, что это микроскоп, описанный профессором Хартингом в Утрехте в 1850 г.)
Линза в настоящее время сильно поцарапана, тем не менее ее нынешние эксплуатационные качества все еще удивительны. С помощью этого микроскопа ван Ситтерт сфотографировал небольшой объект — диатомовую водоросль; полученная картина с увеличением в 300 раз показана на фото 16. Зрелище просто изумительное. Линза может даже в таком состоянии четко разделить два объекта, находящиеся друг от друга на расстоянии всего 1/7000 см. Она вполне успешно выдерживает сравнение с современным хорошим 4-миллиметровым объективом микроскопа, который в сочетании с восьмикратно увеличивающим окуляром дает увеличение 400 X. Если вспомнить, что, прежде чём были созданы современные линзы, были потрачены годы на искусные вычисления, нельзя не признать, каким великолепным настером был Левенгуи. Во всяком случае, если поверить тому, что он писал о сохранении самого лучшего микроскопа для себя (а у нас нет ни малейшего основания сомневаться в этом), то весьма возможно, что современный микроскоп является всего лишь одним из посредственных творений, ми:мо которых он прошел. Левенгуковский «самый лучший» вполне мог быть гораздо лучше тех, которые мы считаем хорошими.
Своего искусства и мастерства Левёнгук нам не передал, так что микроскоп, который развивался исторически, был не однолинзовый, а составной. Большим шагом вперед было открытие ахроматической линзы Джоном Доллондом в Лондоне в 1758 г. Мы коснемся этого вопроса ниже при обсуждении новейших оптических стекол. Здесь же достаточно упомянуть, что Доллонд в конце концов открыл, что сочетание линз, сделанных из различных сортов стекла, в большой мере (хотя и не полностью) исправляет хроматическую аберрацию. Это позволило использовать линзы с большими апертурами, и вскоре шаг за шагом микроскопы стали улучшаться.
К концу XIX в. сложный микроскоп уже достиг высокой степени совершенства. Тогда уже стали понимать, что качество микроскопа определяется четырьмя главными характеристиками: разрешающей способностью, увеличением, контрастом и рабочим расстоянием.
Прежде всего встал самый важный вопрос о разрешении, сводящийся к тому, насколько близко иогут быть друг к другу объекты, чтобы их все еще можно было ясно видеть. Эта проблема изучалась итальянцем Амичи, немцем Аббе и англичанином Релеем. Было показано, что для получения наилучшего возможного разрешения пространство между наблюдаемым объектом и первой линзой (объективом) должно быть заполнено специальным маслом. Впервые было выяснено, что разрешение зависит главным образом от угла светового конуса, стягиваемого линзой объектива. На практике, чтобы получить очень широкоугольный конус, целесообразно иметь линзу с очень малым фокусным рас* стоянием, почти соприкасающуюся с объектом. Если.же пространство между объектом и линзой заполнить жидкостью, подобной маслу, то стягиваемый линзой световой конус, заметно возрастает. Именно требование большого стягивающего конуса приводит к тому, что высокое разрешение можно получить только с короткофокусной линзой.
Как вычисления, так и наблюдения доказали, что наименьшее расстояние, на котором еще можно раздельно увидеть два близких ебъекта, даже с самыми лучшими линзами равно примерно половине длины световой волны, составляющей в зеленой области около 1/40 000 см. Вследствие существования этого оптического ограничения, накладываемого на разрешение близких друг к другу объектов, практически бессмысленно использование микроскопа с увеличением, превышающим 2000. Даже и это увеличение порождает так называемое «дутое увеличение» — всего лишь увеличение размера без выигрыша в деталях. К концу XIX в. предсказанные теоретические пределы как для разрешения, так и для реального увеличения были уже: достигнуты.
Было установлено как теоретически, так и эксперт ментально, что разрешение микроскопа очень тесносвязано с явлением, называемым дифракцией; впервые^ это явление было открыто Гримальди в XVII в. Когда свет проходит через узкую щель, некоторая доля егорасходится в стороны,, и чем уже Щель, тем больше это растекание света во все стороны; когда ширину щели начинают уменьшать до размеров световой волны, свет растекается, охватывая почти весь полукруг вокруг щели.
Если объект будет состоять из большого числа близких друг к другу линий, то оптически это эквивалентно многим щелям, близким друг к другу. Вследствие этого дифрагированный свет концентрируется в определенных направлениях, зависящих от расстояния между линиями. Направим свет от линзы через полосатый предмет, тогда какая-то доля света пройдет насквозь, а другая отклонится от прямого направления встороны. Эти внешние лучи пучка называются дифракционным спектром. Довольно забавно, и это было установлено Аббе совершенно надежно, что микроскоп обнаруживает детальную структуру такого объекта только в том случае, если апертура линзы микроскопа достаточно велика для того, чтобы перехватить дифракционные спектры, исходящие конусообразно от объекта. Если же спектры перехватить не удается, то объект кажется равномерно освещенным, совершенно лишенным структуры. Если линии или щели обстоят друг от друга на довольно большие расстояния, угол дифракционного конуса невелик, линза захватывает эти спектры и детали структуры разрешаются. Если линии наносятся все чаще и чаще, дифракционные спектры распределяются во все более широкоугольном конусе, пока при -определенной близости линий спектрам уже не удается попасть в линзу. Это и есть предел раз-решения. Вплоть до этого момента щелевая или линейная природа объекта разрешается. Дальше уже разрешения нет, и линии нельзя видеть по отдельности, они перекрываются, и объект кажется однородным и лишенным структуры. На рис. 12 линза А не обнаруживает никаких Деталей, для разрешения нужна такая линза, как В. Теперь ясно, зачем нужна большая апертура, если необходимо рассмотреть близкие друг к другу компоненты. Именно дифракция—причина того, что для объекта, состоящего из повторяющихся щелей, отстоящих только на полволны друг от друга, достигается предел разрешения. И Никакое увеличение здесь не поможет.
Третий важный фактор в микроскопии — это контраст.
С обычным микроскопом структуру тонких прозрачных объектов можно обнаружить только в тех случаях, когда между разным властями существует некоторый контраст, возникающий из различий в ырозрачности или цвете. Если тонкий объект состоит, например, из чего-то имеющего форму лестницы, т. е. имеет участки различной толщины и тем не менее все одинаково прозрачные, то микроскоп не выявит различий в толщине. Микроскопйсты XIX в., в особенности занятые биологическими исследованиями, достигли заметных успехов в том, чтобы придавать какой-то контраст объектам и тем самым облегчать распознавание различных структурных элементов прозрачных биологических объектов. В этом отношении огромное значение имело изобретение пятнистого окрашивания. Были разработаны способы осаждения различного цвета красителей на тонкие срезы образцов или на мелкие объекты. Было открыто, что различные структурные детали биологических объектов воспринимают и фиксируют красители в различных дозах, что объясняется отчасти химическим составом клеток и волокон. Таким образом можно было создавать сложную цветовую контрастную картину для изучения того, что иначе казалось бесцветным прозрачным объектом, лишенным структуры. Правда, пятнистое окрашивание в основном можно применять только лишь к неживому материалу.
Определенные оптические приемы для повышения контраста при помощи специальных способов освещения также были разработаны в XIX в. Это темное поле, наклонное и пятнистое освещение и т. д., но их применение ограничено.
Четвертое практически важное свойство микроскопа — рабочее расстояние — создает особую трудность при работе в линзами очень высокого увеличения. Обычно, чем больше увеличение линзы объектива, тем меньше допустимое расстояние между объектом и линзой. Для самых лучших линз XIX в. это рабочее расстояние составляло малую долю миллиметра* мож&т быть, 1/10 мм или меньше, что накладывает целый ряд ограничений на наблюдения.
В течение последних тридцати лет среди значйтеяь* ных достижений в микроскопии самыми важными были следующие: улучшение контраста, в особенности для прозрачных живых объектов; разработка специальных дополнительных приспособлений; рождение новой трехразмерной микроскопии со значительным увеличением благодаря использованию интерференции; применение так называемой флуоресцентной микроскопии * диагностике. В свое время мы обсудим каждое из этих направлений, но сперва рассмотрим новую технику, одновременно увеличивающую контраст и в некоторых.^случаях повышающую разрешение. Речь идет об ультрафиолетовой микроскопии.